小腸(chang)(chang)（hSI）是人類(lei)重要(yao)的(de)(de)(de)器官(guan)，執行著(zhu)包括消化在(zai)內(nei)的(de)(de)(de)眾多功(gong)能(neng)，包括但不(bu)限于初始和(he)(he)(he)選(xuan)擇性屏障活動(dong)、營養吸收(shou)(shou)、宿(su)主-微生物(wu)(wu)(wu)(wu)相互作(zuo)用(yong)，以(yi)及宿(su)主防御和(he)(he)(he)免疫反(fan)應(ying)的(de)(de)(de)調(diao)節。口服給藥是最常見的(de)(de)(de)給藥方(fang)式，許(xu)多藥物(wu)(wu)(wu)(wu)在(zai)小腸(chang)(chang)中(zhong)(zhong)被吸收(shou)(shou)并開(kai)始代謝。過去十年，研(yan)究(jiu)(jiu)者嘗(chang)試總結體內(nei)腸(chang)(chang)道(dao)(dao)復(fu)雜(za)生理功(gong)能(neng)的(de)(de)(de)各個(ge)方(fang)面，并利(li)用(yong)人類(lei)結腸(chang)(chang)腺(xian)癌細胞(bao)系（Caco-2）以(yi)及人工膜系統，來(lai)建立評(ping)估藥物(wu)(wu)(wu)(wu)在(zai)小腸(chang)(chang)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)吸收(shou)(shou)和(he)(he)(he)代謝的(de)(de)(de)實驗模(mo)(mo)型(xing)。然(ran)而，現有的(de)(de)(de)模(mo)(mo)型(xing)無法充(chong)分模(mo)(mo)擬hSI的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)，也無法反(fan)映(ying)藥物(wu)(wu)(wu)(wu)轉運(yun)體、藥物(wu)(wu)(wu)(wu)代謝酶(mei)(mei)和(he)(he)(he)緊密(mi)連接(jie)的(de)(de)(de)表達模(mo)(mo)式所扮演的(de)(de)(de)重要(yao)作(zuo)用(yong)。此(ci)外，這些(xie)模(mo)(mo)型(xing)中(zhong)(zhong)缺乏(fa)細胞(bao)色素P450酶(mei)(mei)(CYP3A4)，而hSI中(zhong)(zhong)最豐(feng)富(fu)的(de)(de)(de)藥物(wu)(wu)(wu)(wu)代謝酶(mei)(mei)正(zheng)是P450，這導致了Caco-2模(mo)(mo)型(xing)不(bu)適合研(yan)究(jiu)(jiu)腸(chang)(chang)道(dao)(dao)首過效應(ying)和(he)(he)(he)生物(wu)(wu)(wu)(wu)利(li)用(yong)度(du)。近年來(lai)，原代人腸(chang)(chang)上皮細胞(bao)（hIEC）模(mo)(mo)型(xing)的(de)(de)(de)發展取得了顯著(zhu)進展，例如3D人體腸(chang)(chang)道(dao)(dao)類(lei)器官(guan)（hIOs）。但由(you)于人體腸(chang)(chang)道(dao)(dao)類(lei)器官(guan)內(nei)缺乏(fa)增殖(zhi)細胞(bao)群，難(nan)以(yi)將腸(chang)(chang)上皮細胞(bao)培養成融合的(de)(de)(de)單(dan)分子層，因此(ci)從人體腸(chang)(chang)道(dao)(dao)類(lei)器官(guan)生成單(dan)層hSI模(mo)(mo)型(xing)十分困難(nan)。

鑒于此，韓國生命工學研究院的一項研究開(kai)發了一種重復性良好的兩步方(fang)法來誘導人多能干細(xi)胞(bao)分化(hua)為(wei)可(ke)擴大(da)的hIEC祖(zu)細(xi)胞(bao)和具有功能性的hIEC單層(ceng)細(xi)胞(bao)。

為了從人多功(gong)能(neng)干細(xi)胞（hPSCs）中獲得單層hSI模型，研(yan)究者建立了一(yi)種新的(de)定向分化(hua)方(fang)案(an)，來(lai)模擬體內(nei)腸(chang)道(dao)發育過程。該方(fang)案(an)采用(yong)激活素A（Activin A）、表皮生(sheng)長(chang)(chang)因子(zi)（EGF）、Wnt信號通路激動(dong)劑(ji)R-spondin 1和(he)胰島素等來(lai)誘導hPSCs向hIEC祖(zu)細(xi)胞分化(hua)，并進一(yi)步分化(hua)為有功(gong)能(neng)性的(de)hIEC。經過長(chang)(chang)時間傳代后（大于(yu)10代，培養(yang)大于(yu)5個月），腸(chang)細(xi)胞標記(ji)物和(he)緊密連接分子(zi)的(de)表達(da)沒(mei)有明顯變化(hua)，腸(chang)上皮功(gong)能(neng)相(xiang)關實驗同(tong)樣使用(yong)Transwell系統。

圖1｜由(you)hPSCs分(fen)化hIECs的過程與相關表(biao)征

由(you)于(yu)在(zai)hSI中，Wnt的(de)(de)抑制和(he)Notch的(de)(de)激活有(you)助于(yu)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)(fen)化(hua)(hua)為吸(xi)(xi)收前上(shang)皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，研究(jiu)者使用了Wnt信號(hao)抑制劑Wnt-c59和(he)Notch信號(hao)激動劑丙戊酸(suan)(VPA)，來(lai)進(jin)一(yi)步將(jiang)hIEC祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)(fen)化(hua)(hua)為與(yu)體內(nei)類(lei)似的(de)(de)成熟且有(you)功能的(de)(de)hIEC。與(yu)其他僅由(you)吸(xi)(xi)收性(xing)(xing)腸(chang)(chang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)組(zu)成的(de)(de)小腸(chang)(chang)上(shang)皮模型相(xiang)比，該系統可以(yi)模擬體內(nei)樣腸(chang)(chang)組(zu)織進(jin)行研究(jiu)。與(yu)未成熟的(de)(de)hIECs相(xiang)比，功能性(xing)(xing)hIECs形成了一(yi)個結(jie)構極化(hua)(hua)的(de)(de)單(dan)層，并觀察到了類(lei)似杯狀細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)(fen)泌(mi)出的(de)(de)粘(zhan)液(ye)。此(ci)外(wai)，功能性(xing)(xing)單(dan)分(fen)(fen)子層hIEC的(de)(de)頂表面接觸的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)菌數量(liang)明顯(xian)更高(gao)，并且黏(nian)液(ye)蛋白(bai)和(he)黏(nian)液(ye)蛋白(bai)相(xiang)關基因的(de)(de)表達在(zai)功能性(xing)(xing)hIEC中顯(xian)著增加能夠允許腸(chang)(chang)道微生物群的(de)(de)持續定(ding)植。

圖2｜功(gong)能(neng)性hIECs單層模型(xing)的結構與功(gong)能(neng)表征(zheng)

隨后(hou)，研究分析了(le)各種腸(chang)道(dao)轉(zhuan)運體(ti)(ti)和(he)(he)代謝酶(mei)的(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)水平，通(tong)過(guo)RNA測(ce)序(xu)與(yu)酶(mei)活性(xing)檢測(ce)，發現(xian)腸(chang)道(dao)堿(jian)性(xing)磷酸酶(mei)（IAP）和(he)(he)CYP3A4在功能性(xing)hIEC中表(biao)達(da)(da)量相當高，這些結果表(biao)明(ming)功能性(xing)hIEC具有(you)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)轉(zhuan)運體(ti)(ti)和(he)(he)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)代謝酶(mei)活性(xing)，是評價藥(yao)(yao)物(wu)(wu)體(ti)(ti)外生物(wu)(wu)利用(yong)度(du)所必需的(de)(de)(de)。本研究使用(yong)了(le)6種臨(lin)床藥(yao)(yao)物(wu)(wu)：美托洛爾、普萘洛爾、雙氯芬酸、雷尼替(ti)丁、呋塞米和(he)(he)紅霉素(su)，進(jin)行(xing)體(ti)(ti)外藥(yao)(yao)物(wu)(wu)吸(xi)收(shou)(shou)試驗，發現(xian)與(yu)Caco-2模型不(bu)理想的(de)(de)(de)體(ti)(ti)內外相關(guan)性(xing)相比，功能性(xing)hIEC與(yu)已公布的(de)(de)(de)人(ren)體(ti)(ti)內腸(chang)道(dao)吸(xi)收(shou)(shou)數據擬合的(de)(de)(de)相關(guan)性(xing)良好，說明(ming)功能性(xing)hIEC可(ke)以(yi)更好地(di)預測(ce)人(ren)的(de)(de)(de)口服(fu)生物(wu)(wu)利用(yong)度(du)和(he)(he)吸(xi)收(shou)(shou)程度(du)。

圖3｜6種臨床(chuang)模型藥物在功能性hIECs與Caco-2模型上吸收的擬(ni)合(he)結果

總而言(yan)之，此(ci)研(yan)究(jiu)發明了一(yi)套可(ke)靠(kao)且完善的hIECs培(pei)養系統，可(ke)以用來產生具有接(jie)近(jin)體內功能的小(xiao)腸上皮單(dan)層，以取代目前的體外(wai)模型(xing)，提供一(yi)個(ge)新(xin)的通用的藥物體外(wai)腸吸收的檢測(ce)平臺。